一、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育與神經(jīng)干細胞
神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起始于胚胎早期的神經(jīng)管和神經(jīng)嵴，其中央管在發(fā)育的終末形成腦室系統(tǒng)和脊髓的中央管，管腔內(nèi)面被覆的細胞為神經(jīng)上皮(neuroepithelium)，具有活躍的增殖和分化能力，在胚胎早期此區(qū)域稱為腦室／腦室下區(qū)(ventricular/subventricular zone，VZ／SVZ)，而在成年后則稱為室管膜／室管膜下區(qū)(ependymal/subepen-dymal zone，EZ／SEZ)，在神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis)過程中起著舉足輕重的作用。
有關(guān)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的起源，長期以來一直存在著爭議，目前被大多數(shù)神經(jīng)生物學(xué)家接受的是“一元論”的發(fā)生機制，即神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞來源于共同的干細胞。這種干細胞由胚胎早期室管膜上皮細胞產(chǎn)生并具有多向分化的潛能，因此被稱為多潛能神經(jīng)干細胞(multipotential neural stem cell)，迄今為止，多潛能干細胞的概念仍不十分確切，因此命名也尚未統(tǒng)一，有的學(xué)者也稱之為前體細胞(precursor cell)或祖細胞(progenitor cell)，總之，代表具有下述特性的一類細胞：(1)可自我復(fù)制或更新(self-renew)，產(chǎn)生與自己相同的子代細胞，維持穩(wěn)定的細胞儲備；(2)處于較原始的未分化狀態(tài)，無相應(yīng)成熟細胞的特異性標志；(3)具有多向分化的潛能，即演變成不同成熟細胞類型的能力。
Lendahl等通過實驗證明中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)多潛能干細胞或前體細胞在胞漿內(nèi)表達一種被稱為巢蛋白或巢素(nestin)特異性蛋白，現(xiàn)已證實其屬于中間絲(intermediate filament)蛋白家族，只在多潛能的神經(jīng)外胚層細胞表達，隨著神經(jīng)上皮的分化成熟逐漸消失，其功能現(xiàn)在尚未*明確，可能與其它家族成員相似，同時具有結(jié)構(gòu)和信息傳遞的功能；通過檢測巢蛋白的表達即可確定多潛能干細胞的存在。另外，利用分子水平的細胞譜系追蹤技術(shù)，通過腦室內(nèi)注射表達熒光蛋白或b-半乳糖苷酶(LacZ)的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染SVZ區(qū)處于分裂期的細胞，可以對干細胞的增殖、移行和分化過程進行監(jiān)視。通過上述方法，目前已經(jīng)證實在成年哺乳類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)至少有兩個區(qū)域存在著具有增殖能力的細胞，即室下區(qū)和海馬結(jié)構(gòu)齒狀回的顆粒細胞層下區(qū)(subgranular zone，SGZ)。這兩個區(qū)域原始細胞的表型目前還不清楚。
二、神經(jīng)干細胞的研究方法
1.體外研究 常規(guī)分離神e799bee5baa6e58685e5aeb931333233656561經(jīng)干細胞的方法是在活體動物腦內(nèi)已經(jīng)確定有細胞分裂的部位切取部分組織，在含有高濃度的致有絲分裂原的培養(yǎng)基中孵育，經(jīng)過增殖后，誘導(dǎo)細胞向不同的子代細胞分化。分化的鑒定通過在單細胞形成子代克隆中，應(yīng)用免疫細胞化學(xué)染色方法檢測神經(jīng)元、星形細胞、及少突膠質(zhì)細胞所表達的特異性抗原。
定義一組體外培養(yǎng)的細胞為多潛能干細胞也存在著許多問題，其中重要的是必須證明這些細胞具有向不同成熟細胞分化的能力。雖然現(xiàn)在*可以應(yīng)用特異性抗體標記神經(jīng)元、星形細胞或少突膠質(zhì)細胞，但是神經(jīng)元的種類有數(shù)百種，若證明真正意義上的“多潛能”尚有很多的工作要做。
目前國外一些研究機構(gòu)相繼報道了建立干細胞系的工作，與原代培養(yǎng)相比，為體外觀察和移植研究提供了較穩(wěn)定的材料；但是應(yīng)用病毒或v-myc等癌基因修飾的“永生化細胞”遺傳特性改變并有繼續(xù)突變的趨勢，可能在移植后生成腫瘤或在分析正?；?qū)ψ哟毎只较驎r產(chǎn)生影響，因而其應(yīng)用價值有待于進一步評價。
2.在體研究 神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化的研究主要通過追蹤干細胞分裂、分化后產(chǎn)生的細胞譜系構(gòu)圖(lineage
mapping)進而了解細胞發(fā)育間的“親緣”關(guān)系。通常認為細胞發(fā)育是由其祖先和環(huán)境因素共同決定，即受細胞內(nèi)外調(diào)節(jié)因素的共同調(diào)控。為進一步確定經(jīng)體外培養(yǎng)鑒定的干細胞的分化潛能，將擴增后／或經(jīng)基因修飾的干細胞移植到腦內(nèi)進行觀察，結(jié)果證明植入的細胞不僅可以在發(fā)育期腦和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛移行，而且向神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞分化，甚至人胚胎來源的干細胞在植入成年大鼠腦內(nèi)也可以分化成為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞；同時發(fā)現(xiàn)移植細胞分化方向似乎由其所處的局部環(huán)境而非內(nèi)在的特性決定，胚胎來源的干細胞沿著宿主細胞移行并分化成為移植部位的特殊細胞類型，植入的細胞在正常發(fā)育的腦內(nèi)對局部信號的適宜反應(yīng)導(dǎo)致了這種“嵌合”現(xiàn)象，使其與宿主細胞很難區(qū)別。Rosario等將培養(yǎng)的干細胞植入基因突變致小腦前葉發(fā)育缺如的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)這些細胞逐漸分化成顆粒細胞并形成小腦的內(nèi)顆粒層；電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示供體細胞分化而來的顆粒細胞與宿主苔蘚纖維建立了突觸聯(lián)系。上述這種顯著的可塑性并不局限在發(fā)育期腦內(nèi)，從成年動物海馬來源的干細胞也可以在植入海馬后分化成為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，與齒狀回正常分化的細胞類型相似；更進一步，這些細胞在植入RMS(rostral migratory
stream)后還可以分化為嗅球神經(jīng)元并具有合成酪氨酸羥化酶的能力，這種酶在正常海馬細胞內(nèi)是不能合成的；而在移植到成年動物正常情況下不產(chǎn)生神經(jīng)元的部位，干細胞則不能生成神經(jīng)元而是向膠質(zhì)細胞分化。令人驚訝的是Bjornson等報道從胚胎或成年小鼠腦內(nèi)取得的細胞經(jīng)標記后移植到放射損傷的宿主鼠體內(nèi)，竟然分化為骨髓細胞、淋巴細胞以及其它原始的造血細胞，其結(jié)果提示神經(jīng)干細胞的分化潛能不只局限于神經(jīng)系統(tǒng)。在受損傷的發(fā)育期腦內(nèi)，干細胞則向損傷部位移行并替代缺失的細胞。由此推測，植入的細胞在分裂增殖的同時，可能“辨別”其所處的環(huán)境，但是什么因素始動分化并決定其分化方向還有待于進一步探索，其中必然交雜著內(nèi)外因素的復(fù)雜作用，供體細胞本身所具有的內(nèi)在分化程序、局部環(huán)境中的神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞外基質(zhì)、黏附分子及細胞間的相互作用均可能參與其中。
3.影響神經(jīng)干細胞增殖分化的因子 在多細胞有機體內(nèi)，每一個細胞的活動均受到極其復(fù)雜的內(nèi)、外環(huán)境信號之間相互作用的調(diào)控，其中生長因子可能是涉及此過程中的主要信號分子。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的各種因子對發(fā)育期細胞的存活、增殖、移行和分化，成年時期功能的維持，損傷時細胞的可塑性改變，都有著非常重要的影響。其中研究中應(yīng)用多的生長因子是EGF和bFGF，已知EGF是星形膠質(zhì)細胞的致有絲分裂原，在體外細胞培養(yǎng)中也可以促進神經(jīng)存活和突起生長，Weiss等證明其對培養(yǎng)的干細胞有明顯的刺激增殖作用，其子代細胞可向神經(jīng)元、星形細胞和少突膠質(zhì)細胞分化。bFGF據(jù)報道也具有相同的作用，而且在低濃度下尚有誘導(dǎo)干細胞向神經(jīng)元分化的作用。當(dāng)EGF和bFGF注射入成年鼠腦室內(nèi)，EGF可強烈刺激SVZ細胞增殖，對SGZ的細胞則無作用；bFGF的作用相對較弱；但是新生鼠通過注射bFGF則可導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)元的數(shù)目增多。已經(jīng)檢測具有相類似作用的還有神經(jīng)生長因子、血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子等，但是它們的作用機制仍不清楚。
三、神經(jīng)干細胞的應(yīng)用前景
1.細胞移植 以往腦內(nèi)移植或神經(jīng)組織移植研究進展緩慢，主要受到胚胎腦組織的來源、數(shù)量以及社會法律和倫理等方面的限制。神經(jīng)干細胞的存在、分離和培養(yǎng)成功，尤其是神經(jīng)干細胞系的建立可以無限地提供神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，解決了胎腦移植數(shù)量不足的問題，同時避免了倫理學(xué)方面的爭論，為損傷后進行替代治療提供了充足的材料。研究表明，干細胞不僅有很強的增殖能力，而且尚有潛在的遷移能力，這一點為治療腦內(nèi)因代謝障礙而引起的廣泛細胞受損提供了理論依據(jù)，借助于它們的遷移能力，可以避免多點移植帶來的附加損傷。另外，神經(jīng)干細胞移植也為研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及可塑性的實驗研究提供了觀察手段，前文提及細胞因子參與調(diào)控神經(jīng)元增殖和分化，通過移植的手段對這些因素的具體作用形式和機制進行探索，為進一步臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。
2.基因治療 目前誘導(dǎo)干細胞向具有合成某些特異性遞質(zhì)能力的神經(jīng)元分化尚未找到成熟的方法，利用基因工程修飾體外培養(yǎng)的干細胞是這一領(lǐng)域的又一重大進展；另外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多細胞因子可以調(diào)節(jié)發(fā)育期甚至成熟神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性和結(jié)構(gòu)的完整性，將編碼這些遞質(zhì)或因子的基因?qū)敫杉毎?，移植后可以在局部表達，同時達到細胞替代和基因治療的作用。
3.自體干細胞分化誘導(dǎo) 移植免疫至今為止仍是器官或組織移植的首要問題。前文提到已經(jīng)證明成年動物或人腦內(nèi)、脊髓內(nèi)存在著具有多向分化潛能的干細胞，那么使人們很容易想到通過自體干細胞誘導(dǎo)來完成損傷的修復(fù)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，首先反應(yīng)的是膠質(zhì)細胞，在某些因子的作用下快速分裂增殖，形成膠質(zhì)瘢。其實在這個過程中也有干細胞的參與，可不幸的是大多數(shù)干細胞增殖后分化為膠質(zhì)細胞，什么機制控制著細胞的分化決定，確切機制尚未明了。一旦這個機制被發(fā)現(xiàn)，無疑對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)來講是一個重大的飛躍，因為它不僅可以避免移植造成的不必要損傷，更重要的是可以避免排斥反應(yīng)。體外實驗已經(jīng)證明某些因素的誘導(dǎo)分化作用，但是應(yīng)用到臨床尚有一段距離，可我們?nèi)詮那笆龀晒Φ奶剿髦锌吹较Ｍ⑾嘈旁谶@方面的突破即將到來。