一、EPCs的表面標(biāo)志概述

 

　　EPCs的鑒定依賴于其特異性表面抗原的表達(dá)。這些標(biāo)志物主要包括CD34、VEGFR-2（血管內(nèi)皮生長因子受體-2，也稱為KDR或Flk-1）和CD133等。然而，EPCs不是單一群體，可分為早期和晚期EPCs，其標(biāo)志物表達(dá)存在動態(tài)變化。例如，早期EPCs高表達(dá)CD133和CD34，但低表達(dá)VEGFR-2；而晚期EPCs則高表達(dá)VEGFR-2和vWF（vonWillebrand因子），CD133表達(dá)下降。在大鼠模型中，這些標(biāo)志物與人類和小鼠具有高度同源性，但需注意物種特異性差異。

 

　　二、主要表面標(biāo)志及其鑒定方法

 

　　1.CD34：CD34是一種跨膜糖蛋白，廣泛表達(dá)于造血干細(xì)胞和EPCs表面，是EPCs鑒定的基礎(chǔ)標(biāo)志物。在大鼠骨髓中，CD34陽性細(xì)胞通常代表EPCs群體。鑒定時，可采用流式細(xì)胞術(shù)：首先從大鼠骨髓中分離單個核細(xì)胞（通過密度梯度離心法），然后用抗大鼠CD34抗體（如PE或FITC標(biāo)記）進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞儀分析陽性細(xì)胞比例。同時，免疫熒光染色可結(jié)合顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

 

　　2.VEGFR-2(Flk-1)：VEGFR-2是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體，在EPCs中高表達(dá)，是區(qū)分EPCs與造血干細(xì)胞的關(guān)鍵標(biāo)志。在大鼠中，VEGFR-2的檢測可使用抗大鼠Flk-1抗體。通常采用雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)：同時標(biāo)記CD34和VEGFR-2，CD34+/VEGFR-2+雙陽性細(xì)胞被視為EPCs。此外，免疫組化可用于組織切片分析，驗證EPCs在骨髓中的定位。

 

　　3.CD133：CD133是一種早期干/祖細(xì)胞標(biāo)志，在未成熟的EPCs中高表達(dá)，但隨著細(xì)胞分化而下降。大鼠CD133與人類CD133同源，可用特異性抗體檢測。在流式細(xì)胞術(shù)中，CD34+/CD133+細(xì)胞群體代表早期EPCs；結(jié)合VEGFR-2，可進(jìn)一步提高鑒定準(zhǔn)確性。注意，CD133表達(dá)可能隨培養(yǎng)時間變化，因此需在分離后盡早檢測。

 

　　4.其他標(biāo)志物：vWF、CD31和UEA-1（荊豆凝集素-1）等內(nèi)皮標(biāo)志物也可用于輔助鑒定。例如，通過免疫熒光雙染色（如CD31與VEGFR-2結(jié)合）可確認(rèn)EPCs的內(nèi)皮特性。功能實驗如體外成管實驗（Matrigelassay）可驗證這些標(biāo)志物陽性細(xì)胞的血管形成能力。

 

　　三、鑒定流程與注意事項

 

　　鑒定大鼠骨髓EPCs的表面標(biāo)志通常包括以下步驟：

 

　　-細(xì)胞分離：通過穿刺獲取大鼠骨髓，使用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞。

 

　　-細(xì)胞培養(yǎng)：在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（如EGM-2）中培養(yǎng)，富集EPCs。

 

　　-表面標(biāo)志檢測：采用流式細(xì)胞術(shù)或多色免疫熒光進(jìn)行定量和定性分析。建議使用多標(biāo)志物組合（如CD34、VEGFR-2和CD133），以避免單一標(biāo)志物的局限性。

 

　　-功能驗證：通過DiLDL攝取實驗和成管實驗確認(rèn)EPCs的功能，確保表面標(biāo)志與生物學(xué)行為一致。

 

　　注意事項：

 

　　-物種特異性：大鼠抗體需選擇高特異性試劑，避免交叉反應(yīng)。

 

　　-動態(tài)變化：EPCs的標(biāo)志物表達(dá)隨培養(yǎng)時間和微環(huán)境變化，需在多個時間點檢測。

 

　　-純度控制：結(jié)合陰性標(biāo)志（如CD14和CD45）排除單核細(xì)胞和造血細(xì)胞污染。